蛍光計キット:感度サンプル定量のための実用ガイド

分子生物学の実験室では、蛍光を用いた蛍光計キットを使ってDNA、RNA、またはタンパク質を測定できます。これらのアッセイは、全UV吸収度を測定するのではなく、特定のターゲットに結合したときに信号が強い染料に基づいています。この選択性は、サンプルが希釈されている、体積が小さい、または吸収測定に干渉する可能性のある他の物質で汚染されている場合に有利です。

フルワークフローには、通常、アッセイ試薬、希釈バッファー、標準物質、アッセイチューブまたはアッセイプレート、そして手順に適したフルオロメーターが含まれます。アッセイの範囲は信頼性の高い結果を得るために重要であり、標準の調製の一貫性、試薬の不適切な光曝露からの保護、そしてすべての希釈が正確に記録されることも重要です。

蛍光計キットには、蛍光測定に必要なすべての材料と用品が含まれています

ほとんどの蛍光計アッセイキットは、高濃度蛍光染料、アッセイバッファー、リファレンススタンダードで構成されています。一部のキットにはチューブ、プロトコルカード、または器具ごとのアッセイ設定も含まれています。

染料の化学反応がアッセイで測定される決定的な要素となります。選択的なdsDNA定量は、二本鎖DNAキットで行うべきです。RNA、一本鎖DNAおよびタンパク質アッセイは異なる結合化学に基づいており、互換性はありません。

一例として、商業用dsDNAキットには濃縮アッセイ試薬、希釈バッファー、希釈済みDNA標準物質が含まれていることがあります。他にも、単管またはマイクロプレート蛍光計と互換性のある試薬を適切な励起および発光波長で供給するシステムがあります。

時には蛍光の方が紫外線吸収よりも優れていることもあります

紫外線分光光度法による核酸濃度の推定は、260nmでの吸収度に基づいています。純度比には迅速かつ有用ですが、塩、遊離ヌクレオチド、タンパク質、RNA、DNA、その他の有機化合物は吸収シグナルを引き起こすことがあります。

蛍光アッセイは、選択された分析対象物により特異的に作られます。これは、潜在的な汚染物質を含む可能性のある低濃度やサンプルの精度向上に役立ちます。したがって、蛍光定量は特定のDNA、RNA、タンパク質の測定においてUV吸収よりも感度が高く選択的です。

両方の方法は組み合わせて使用可能です。蛍光は特定のターゲットの濃度を測定するために用いられ、紫外線吸収はより一般的な純度測定を可能にします。

分析量と測定範囲のキットを選びましょう。

一般的な蛍光計キットには、以下のような種類があります:

• 高感度dsDNAアッセイ
• 広範囲dsDNAアッセイ
• RNAアッセイ
• ssDNAアッセイ
• タンパク質アッセイ
• RNA品質アッセイ

低濃度抽出物や準備済みのシーケンシングライブラリーは高感度アッセイで検出可能です。高濃度試料には狭範囲アッセイの方が適しています。検証範囲外のサンプルは希釈が必要で、結果の信頼性が低下することがあります。

高感度キットとブロードレンジキット間の定量範囲は異なり、同じ分析対象の場合もあります。したがって、アッセイはサンプル名だけでなく、予想される濃度に基づいて選択すべきです。

キットは蛍光計と互換性がある必要があります。励起・放出チャネル、チューブ/プレートフォーマット、試料体積、校正方法、プログラムされたアッセイオプションを検証します。特定のプロトコルを一部のフルオロメーターに事前プログラムしてdsDNA、RNA、ssDNA分析を行うこともでき、他はカスタムプログラムも可能です。

サンプルボリュームとスループットの定義を書きます

サンプルの入手が困難な場合や、下流の実験のために保存が必要な場合に、小容量は有用です。一部のベンチトップ蛍光測定システムでは数マイクロリットルの試料が必要ですが、通常はより大きな作業用溶液に試料が投入されます。

スループットも重要な要素です。時折の測定や小規模なバッチには、単管蛍光計が適している場合があります。多数のサンプルを扱う検査室では、複数の抽出サンプルや複数のシーケンスライブラリを処理できる機器やマイクロプレートワークフローが好まれることがあります。

すべての楽器が実用的というわけではありません。良いシステムは、繰り返しのピペッティングを最小限に抑え、通常の準備を容易にし、ラボが日常的に取り扱う実際のサンプル数にマッチするべきです。

一貫したアッセイワークフローを追求すること

以下は標準的なフルオロメーターキットのプロトコルです:

• A.作業中の解決策は準備済みです。動作する解決策が作られます。
• 必要な基準の策定
• 未知のサンプルを追加する
• サンプルとスタンダードを徹底的にミックスすること
• 指定された期間の潜伏
• 不適切な光への曝露による反応の防止
• 定規を使って脳の幅と長さを測ること。9.定規を使った脳の正確な測定。
• 試料の希釈係数の適用

校正済みピペットを使用して、標準物質やサンプルを同じ方法で準備・使用してください。ピペッティング工程が低体積で行われる場合、体積のわずかな誤差が最終濃度に大きな差を生むことがあります。

孵化にかかる時間も重要です。最初に1つのサンプルを採取し、さらにかなり後から別のサンプルを採取すると、不要な変動が生じる可能性があります。また、標準サンプルとサンプル間の温度差に敏感なアッセイもあります。

標準、ブランク、レプリケートを適切に使用してください

標準は分析物の量と蛍光強度を関連付けるために用いられます。十分に混ぜ、適切にラベルを付け、汚染から守るべきです。

未知の試料をブランクに挿入すると、測定される信号は試薬、バッファー、チューブ、または背景試料マトリックスによるものです。サンプルが価値がある場合、正確な濃度がアッセイ限界に近い場合、または予期せぬ結果がコストのかかる下流プロセスに影響を与える場合には、重複測定が有効です。

もし重複した読み取り値が一致しない場合は、単に平均を取るのではなく。ピペッティングの精度、試料混合、気泡の有無、チューブの清浄度、培養時間、温度、選択した測定範囲を検証します。

男性と女性は痛みの測定方法が異なります

蛍光測定結果の信頼性が低い一般的な理由は以下の通りです:

• 標的に対して誤ったアッセイの選択
• 不適切な感度範囲の選択
• 保管や準備に適切な容器を使っていないこと
• サンプルボリュームの不均一さの追加
• 標準規格や作業中の溶液中の汚染物質の存在。
• 光路に気泡を残すための罠です。
• 傷ついた管や互換性のない管の使用は禁止されています。傷や互換性のない真空管は許可されていません。
• 光に敏感な試薬への過剰な曝露
• 希釈によって標本の細胞数が減ることは考慮しないでください。
• 検証済みデバイスの範囲外での使用。

濃縮試料はピペットや作業場所を汚染し、将来の低濃度試料にも影響を及ぼす可能性があります。これは新しい先端、きれいな作業面、合理的なサンプル順序によって最小限に抑えられています。

測定値をダウンストリームワークフローにドラッグして接続してください

蛍光計キットは、PCR、qPCR、クローニング、シーケンシングライブラリーの準備、電気泳動、トランスフェクションなど、制御されたサンプル入力を伴うワークフローの前に頻繁に使用されます。

定量化は、試料の正規化、抽出収量の比較、一貫した反応入力を得るために重要です。RNAアッセイ(蛍光ベース)は、RT-PCRやcDNAライブラリー調製などの他の応用に先行して適用されます。DNA定量はPCR、クローニング、トランスフェクション、次世代シーケンシングなど、さまざまな下流の応用に応用されています。

したがって、キットの選択は測定後の判断に基づいて調整されるべきです。通常の抽出チェックには広範囲のアッセイを用い、低入力シーケンス作業にはより感度の高いアッセイを用いることができた。

試薬は常に適切に保管し取り扱いましょう

蛍光試薬は光、温度、取り扱いに敏感である場合があります。キットの指示に従って保存、加熱、混合、有効期限を管理してください。すべての蛍光染料が凍結、室温保存、実験室の光にさらされるわけではありません。

作業中の解決策を明確にマークし、作成日を記録することを忘れないでください。元の試料が変わったと疑う前に、試薬の年数、試薬保管履歴、標準、ピペット、計測器の設定、温度およびチューブの適合性を確認してください。

結論

蛍光計キットは、特に価値のあるサンプルや希釈サンプルにおいて、DNA、RNA、またはタンパク質の定量を検出するために感度が高く選択的です。信頼性の高い測定には、分析対象物および濃度範囲に適したアッセイ、適切な蛍光計の使用、標準物質の一貫した調製、そしてプロセス全体の制御が必要です。

検出限界が最も低いキットが最良のキットとは言えません。それは、検査室のサンプルの種類、処理量、下流の適用範囲、品質管理の要件に合致するものである。

よくある質問

Q1。 蛍光計キットの用途は何ですか?

dsDNA、ssDNA、RNA、そして一部のRNA品質検査にはいくつかの異なるキットがあります。スクリーニングに用いられる方法の化学成分は対象に適している必要があります。

Q2。 蛍光計キットと紫外線法、どちらがより効果的ですか?

彼らは特定の分析対象に対してより特異的で敏感である傾向があります。UV吸収は、準最終純度試験や試料全体の純度測定において依然として有効とみなすことができます。

Q3。 どれくらいのサンプルが必要ですか?

検査や器具によって体積は異なります!実際、多くのベンチトップシステムがあり、元のサンプルを数マイクロリットルだけで十分に利用可能です。

Q4。 DNA RNAのアッセイに使われる試薬は何ですか?

通常は選択的にではありません。通常の適用では、DNAやRNAの含有量を測定したい場合があり、アッセイは1対1または両方に特異的である場合があります。

Q5。 異なるレプリケートの結果にばらつく原因は何ですか?

これらはしばしばピペッティング誤差、不十分な混合、気泡、汚染、温度や測定誤差の範囲によって引き起こされます。