Gタンパク質結合受容体:細胞シグナル伝達から創薬へ

Gタンパク質結合受容体、略してGPCRは、細胞が細胞外からの信号に反応するのを助ける膜タンパク質です。これらの信号にはホルモン、神経伝達物質、脂質、ペプチド、さらには光が含まれます。

GPCRの7連膜構造には明確な共通点がありますが、同じ機能を持ちません。実験結果は、受容体のリガンド、細胞の環境、受容体の発現レベル、シグナル伝達パートナーによって異なる場合があります。

したがって、研究者は化合物の受容体の「活性化」という測定を超えて、GPCRの生物学を解読しなければなりません。経路、タイミング、アッセイ形式、コントロール、セルモデルは非常に重要です。

Gタンパク質結合受容体:それは何でしょうか?

典型的なGPCRが細胞膜を通過する回数は7回です。細胞外部分はシグナル分子に結合し、細胞内部分はGタンパク質、アレスチン、キナーゼ、その他のシグナル分子に結合します。

GPCRはIUPHAR/BPS薬理学ガイドによって、クラスA、クラスB、クラスC、フリズル受容体および癒着受容体など、いくつかの主要なクラスに分類されています。クラスAは最大で、アドレナリン作動性、ドーパミン、オピオイド、ムスカリン受容体などのよく知られた標的を含みます。

構造は似ていますが、GPCRは非常に多様な信号群を認識できます。これにより、感覚知覚、心血管の調整、代謝、免疫機能、気分、運動など、さまざまな機能に関与できるようになります。

GPCRはどのようにしてアクティベートされるのか?

リガンドが受容体に結合し、受容体の形状を変えます。この立体構造の変化により、受容体は細胞内のシグナル伝達タンパク質と相互作用できるようになります。

多くのGPCRは、α、ベータ、ガンマサブユニットからなる最初のパートナーとしてヘテロトリメリックGタンパク質を持っています。受容体の活性化により、アルファサブユニットでGDPがGTPに交換されます。活性化された成分は、下流の酵素、イオンチャネル、セカンドメッセンジャーに影響を与えます。

最も一般的なGタンパク質ファミリーは以下の通りです:

• Gsは通常、環状AMPの増加を引き起こします
• 環状AMP還元酵素の一般的な名称はgi/oです。
• ホスホリパーゼCおよびカルシウム経路をシグナル化するGq/11経路
• ローファミリーのタンパク質および細胞骨格応答はG12/13によって制御可能です。

この教科書の説明は役立ちますが、ラインは珍しいシグナルの形態です!単一の受容体は複数のGタンパク質を介してシグナルを送ることができ、最適なシグナル伝達はリガンドや細胞の種類によって異なる場合があります。GPCRdbは、受容体がGタンパク質、GPCRキナーゼ、アレストンと相互作用し、さまざまな細胞内シグナル伝達経路の形成につながると述べています。

逮捕者の役割

Gタンパク質が活性化されると、GPCRsによるシグナル伝達は止まりません。

GPCRキナーゼは活性化された受容体をリン酸化することができます。アレスチンは受容体と相互作用し、受容体とGタンパク質のさらなる結合を阻害し、受容体の内部化を促進し、他のシグナル伝達経路に関与する可能性があります。

したがって、逮捕の募集は「オフスイッチ」とはみなされません。受容体や実験によっては、受容体の輸送、脱感作、リサイクル、分解、またはその他の下流効果の調節に影響を与えることがあります。

Gタンパク質シグナル伝達とアレスチンのリクルートメントは、化合物の完全な薬理学的指標として重要なため、しばしば一緒に測定されます。

このセクションの記事では、同じ受容体がどのように異なる反応を引き起こすかを検証しています

GPCRは単なるオン/オフスイッチではありません。

受容体の異なる立体構造相に結合するさまざまな配位子が見られます。一方のリガンドは一方のGタンパク質経路で高いレベルの活性化を引き起こすことがありますが、もう一方の経路ではレストンのリクルート増加や異なるシグナル伝達プロファイルが異なります。これは一般的に機能選択性/バイアスシグナルと呼ばれます。

細胞の背景も重要です。同じ受容体は2つの異なる研究室で見つかりますが、細胞内のGタンパク質、アレストン、キナーゼ、酵素、または内因性受容体の量が異なります。

もう一つの問題は受容体の発現レベルかもしれません。過剰な発現は低活性レベルへの反応を強めたり、結合の好みを変えたり、部分作動薬が細胞内での活性が自然組織よりも強くなる原因にもなります。

したがって、結果は受容体だけでなく、完全な実験システムの挙動を示す指標として捉えるべきです。

生物学的な質問に基づいてアッセイを選択します

すべての疑問に答えられるGPCRアッセイは一つではありません。

cAMPアッセイ

GsやGiタンパク質を含む受容体は通常、cAMPを用いて測定されます。Gs反応はcAMPの増加をもたらす可能性があり、Gi反応は刺激されたcAMP産生の阻害によって示される可能性があります。

これらのアッセイは、濃度反応研究、作動薬の特徴付け研究、そしてアンタゴニスト研究で一般的に用いられます。アンタゴニスト実験では、テスト化合物が細胞に曝露された後に通常、アゴニストの濃度を適用します。

カルシウムアッセイ

Gq結合受容体は細胞内カルシウムのアッセイで研究されることがあります。これらは迅速かつ高いスループットの読み取り結果を出せますが、応答時間が短く、細胞の取り扱い、色素の充填、受容体発現、測定時間に大きく依存することがあります。

GTPγS 結合

GTPγSアッセイはGタンパク質活性化過程で測定される最も初期のイベントの一つであり、膜製剤における作動薬の活性を確認するためによく用いられます。このアッセイは受容体とGタンパク質の相互作用にかなり近いため、下流の読み取りで受ける増幅を多少軽減できます。

逮捕募集

アレストンアッセイは、経路バイアス、リガンド特異的シグナル、受容体輸送、受容体脱感作の調査に用いられます。これらは受容体の活性化の一般的な指標としてではなく、Gタンパク質アッセイと併用して使用するのが最適です。

ライブセルバイオセンサー

BRETやFRET技術(およびその他のバイオセンサー手法)は、生細胞内のシグナル伝達イベントを時間の関数として追跡できます。最大の売りは動力学的情報です。研究者は複数のエンドポイントを測定することで、シグナル伝達がいつ始まり、ピークに達し、その後低下するかを測定できます。

正確なGPCR実験を行ってください

良いアッセイは器具ではなく生物学的製剤に基づいています。

まずは、受容体が発現し、細胞膜の正しい位置にあることを確認してください。低い反応はリガンドの活性低下によるものではなく、受容体の発現や輸送不良による可能性があります。

次に、適切な制御装置を追加してください。一般的には、既知の作動薬、既知のアンタゴニスト、車両制御、非遺伝子組み細胞、および受容体非依存制御が下流アッセイに必要となることがあります。

最後に、完全な集中応答曲線を行います。化合物の濃度が1つだけの評価では、活性、有効性、部分的作動作用、毒性、または非特異的干渉の信頼できる指標にはなりません。

タイミングの標準化も必要です。カルシウム信号が数秒以内に受け取ったら、数時間後に遺伝子発現を測定するだけでは、単純に比較することはできません。同じ受容体を測定する検査は、反応の異なる段階を測定するために用いられます。

最後に、直交アプローチを用いて有意な結果を検証します。化合物がcAMPアッセイで活性が判明した場合は、他の有用なアッセイ、結合アッセイ、または受容体特異的陽性対照で確認するのが最善です。アッセイガイダンスマニュアルは、リード最適化に向けたGPCRヒットの慎重な検証、品質管理、薬理学的特徴付けが推奨されることを示唆しています。

創薬のためのGPCRs

GPCRは生理学の多くの側面に関与し、細胞表面に発現するため、創薬において重要な役割を果たし続けています。GPCRdbは、ヒトホルモンの25%がこの受容体ファミリーのメンバーに反応していると推定しており、全薬剤の約3分の1がこの受容体ファミリーのメンバーを標的としています。

従来のプログラムでは、主な探索ターゲットは主要なリガンド結合部位に結合するアゴニストかアンタゴニストでした。アロステリックモジュレーター、経路バイアス配位子、受容体–トランスデューサー選択性、結合速度論、構造ベースの化合物設計の研究も現在進行中です。

構造生物学の登場により、これがより現実的になりました。GPCRdbには、実験的に決定された受容体構造、受容体-リガンド複合体、受容体-Gタンパク質複合体など、GPCRの結合部位や活性化状態を比較するツールが含まれています。

構造が良い化合物は、構造が良好であっても機能試験を受けるべきです。分子は適切な標的に強い結合親和性で結合しても、意図した細胞応答を誘発しない場合、あるいは望ましい経路に関与しても正しい方法では関与しない場合もあります。

結論

Gタンパク質結合受容体は単なる膜スイッチではなく、柔軟なシグナル伝達システムとして考えるのが最適です。

受容体はリガンド結合に応じて形状を変え、受容体は細胞内のパートナーを見つけ、細胞の環境が信号の流れを決定します。そのため、アッセイの選択、受容体の発現、経路のタイミング、コントロール、直交検証を考慮することが重要です。

GPCRの研究と創薬における最良の結論は、構造情報と複数の機能的アッセイの組み合わせによってしばしば導かれます。

よくある質問

Q1。 GPCRの主な機能は何ですか?

GPCRは細胞表面受容体で、細胞外信号に反応し、細胞内反応を生み出します。答えはGタンパク質、アレストン、セカンドメッセンジャー、イオンチャネル、遺伝子調節などによるものかもしれません。

Q2。 すべてのGPCRは同じGタンパク質によって活性化されるのでしょうか?

いいえ。さまざまな受容体は、さまざまなGタンパク質(Gs、Gi/o、Gq/11、G12/13、または複数のシグナルパートナー)を活性化することを好みます。

Q3。 オーファンGPCRとは何ですか?

孤児GPCRとは、自然に活性化するリガンドが確定していない受容体です。これらの受容体は依然として基礎研究や薬剤開発において重要な役割を果たしています。

Q4。 では、GPCRスクリーニングにはどのアッセイを使うべきでしょうか?

「最適」なアッセイは、扱う質問と受容体のシグナル伝達経路によって異なります。応答のさまざまな側面は、cAMP、カルシウム、GTPγS、アレストン、および生細胞バイオセンサーアッセイで測定できます。

Q5。 研究者が複数のアッセイを用いる理由は何ですか?

1つのアッセイは1つの経路のみを測定するか、特定の干渉をフォーマットすることができます。もし直交アッセイで観察された効果が確かに受容体に関連していることを証明できれば、これは本当に受容体の効果であると結論づけることができます。