分子生物学イメージングシステム:ゲルとブロットに適したプラットフォームの選択

分子生物学イメージングシステムは、ゲルや膜のデジタル出力を提供し、それを閲覧、定量化、保存、比較が可能です。DNAやRNAを含むゲル、染色されたタンパク質ゲル、化学発光ウェスタンブロット、蛍光ブロット、比色サンプルのスキャンが可能です。

システムはアッセイに適合させるために使うべきであり、その逆ではありません。

分子生物学イメージングシステム(MOM)はどのように機能するのか?

標準的なイメージングシステムは、遮光チャンバー、カメラ、レンズ、サンプルステージ、望ましい励起に使用できる光源、特定の発光周波数の光のみを通過させるフィルター、画像を記録するカメラ用ソフトウェア、そして画像解析用のソフトウェアが含まれます。

核酸ゲルの場合、器具は蛍光染色にUV、青色、または適切な光を照射します。白光は、目に見えるタンパク質ゲルによく使われます。化学発光のウェスタンブロットで生成される光は自ら作り出され、化学反応から来るため、感度の高いカメラと暗いイメージングチャンバーが必要ですが、試料に強い光を浴びせる必要はありません。

一部のオールインワンプラットフォームは、ゲル記録、比色イメージング、化学発光、蛍光を一つの筐体内に収めています。例えば、bio-Radは核酸ゲルやタンパク質ゲル、化学発光ブロットの画像化システムを提供し、可視光チャネル、遠赤赤線、近赤外蛍光チャネルでシステムを拡張できます。

まずは自分が実行するサンプルから始めることができます

まず最初に始めるのは実験台であって、仕様書に載っているわけではありません!

アガロースゲルを主に研究する教育実験室では、UV、ブルーライト、ホワイトライトイメージングのみが求められる場合があります。正確なタンパク質研究室には、繊細な化学発光と複数の蛍光チャネルが必要です。

サーモフィッシャーは、可視化システムを単純に可視化するものと、ソフトウェア解析や化学発光ウェスタンブロット、多チャネル蛍光イメージングを提供するものに分けています。便利な注意点として:ゲル記録システムは、マルチモード分子イメージャーのような機器のレベルではありません。

励起源とフィルターを染料に合わせてください

各蛍光染料は、その照明と光の発光に最適な波長範囲を持っています。イメージングシステムには、染料を励起させるための適切な光源と、蛍光光子がカメラに届き、染料励起に使われる光を放出する発光フィルターを備える必要があります。

以下は、含まれるシステムの例です:

• 紫外線トランスイルミネーション
• ブルーライトトランスイルミネーション
• 白色透過光
• 白色の反射光
• 可視蛍光励起
• 近赤外蛍光励起

光源の数とその品質には相関関係がありません。重要なのは、設置される波長やフィルターが、すでに実験室で使われている染色、抗体、蛍光ラベルと互換性があるかどうかです。

システムを購入する前に、検査室の試薬リストを確認し、アプリケーションが対応しているか確認してください。すべての蛍光染料が捕捉できるわけではなく、このシステムは「蛍光イメージャー」と呼ばれています。

化学発光と蛍光は非常に似ています

化学発光ウェスタンブロッティングでは、光は通常抗体酵素と発光基質に基づく化学発光反応によって生成されます。信号は時間とともに変化します。試薬の推奨作業時間の範囲内でイメージングを開始するべきです。

蛍光によるウェスタンブロットは励起の外部光を必要とします。実験の多重化にも用いられ、異なる蛍光チャネルを通じて同一膜上の複数の標的を検出できます。

化学発光は一般的に感度の高い日常的な検出に用いられます。多重化や安定信号の捕捉、定量的比較が重要な場合、蛍光が選ばれることが多いです。最善の方法は一つではなく、アッセイの要件、標的量、抗体、使用されるラベル、分析目的によって異なります。

もし検査室が両方の検査を日常的に実施しているなら、提案されたシステムが検査をそのまま、複雑なハードウェア変更を伴わずに実行できるようにすべきです。

撮影時にはダイナミックレンジと彩度を考慮してください

一部のブロットは非常に強いバンドが1つ、いくつかの弱いバンドを持つことがあります。強い帯域は、露出時間が十分に長くあってかすかな信号が見える場合、飽和状態になるかもしれません。

カメラのピクセルがもう撮影できなくなるほどの光が強い場合です。その後は表示バンドの見かけ上の明瞭さは保持されますが、強度のレベルは定量的比較には使えなくなります。

ダイナミックレンジとは、イメージングシステムが単一の画像に記録できる弱信号から強い信号の範囲です。大きなダイナミックレンジにより、かすかで強い帯の記録が容易になり、情報を失うことはありません。

一部のイメージングプラットフォームは、彩度の高いピクセルを検出したり、適切な露光を提案したり、複数回露光を使用したりすることができます。試行錯誤の回数を減らすことはできますが、優れた実験設計の代替となるものではありません。サンプルが過負荷であっても、アッセイ段階で補正し、強すぎる抗体シグナルも補正すべきです。

自動露出の使用は避けるべきです

自動露出は、複数の人が交代で機器を操作する場合や、信号強度の測定が困難な要因がある場合に役立ちます。

一部のシステムは初期の曝露が短いもので、それに基づいて全体の曝露量を提案します。光源、焦点、適用設定は他の人が自動的に選択します。

これにより通常の画像処理が速くなるかもしれませんが、必ずオペレーターに確認してください。以下を確認してください:

• 注:重要な帯域では飽和度が示されています。
• 背景の上に弱い帯が見えます
• 全視野が完全なサンプルでカバーされています。
• 最良の結果を得るために、正しいイメージングモードが使用されました。
• 必要なフィルターとトレイが使われました
• 以下は定量分析であり、曝露スーツが必要です:

自動設定は良い出発点ですが、画像をチェックしない言い訳にはなりません。

解像度、感度、視野がすべて正しいことを確認してください

解像度はカメラで撮影される画像にとって重要ですが、メガピクセル数がカメラの撮影品質を示す指標ではありません。

また、十分に感度が高く、背景が低く、光学性能が良く、均一で、実験室で使用されるゲルや膜を収容できる十分な視野を持つ有用なシステムを持つことも重要です。

化学発光信号が弱い場合は、非常に高感度のカメラが必要になります。バンド間の距離が大きいほど、必要な解像度は低くなります。バンド間の距離が短く、解像度の重要性が高く、分離すべきサンプルの特徴量が小さいほど、より多くの解像度が必要です。

購入前に、画像診断部位に最大のラボゲルトレイ、ブロット、またはマルチゲルトレイを置いてください。大きなゲルを複数の画像に切り分けると労力が無駄になり、比較が難しくなります。

画像が一貫して取得されていることを確認してください

画像を比較する際は同じ条件下で撮影することが推奨されます。

イメージングモード、光源の種類、フィルター、露光時間、ビン、フォーカス、サンプル位置、分析設定、背景および背景補正を書きます。必要に応じて、保存したプロトコルを再利用してください。

染色や染色を除去する場合は、核酸ゲルとタンパク質ゲルの条件が同じであることを確認してください。ウエスタンブロットでは対照サンプルの負荷、抗体濃度、基質の投与時間、膜の取り扱いを制御します。

イメージャーは、入れたサンプルだけを記録できます。不均一な転移、過剰な背景、過負荷のレーン、抗体特異性の欠如を修正することはできません。

解析ソフトウェアのテスト

画像解析ソフトウェアで一般的な作業は難しくなく、ソフトウェアが結果の生成を妨げてはなりません。

便利な関数としては以下のものがあります:

• レーンおよびバンド検出
• 分子量推定
• 背景の引き算
• バンド強度測定
• 飽和警報
• 正規化
• マルチプレックスチャンネル表示
• 画像注釈
• データエクスポート
• ユーザーや実験が記録されるとき。

組み込みの分析機能は日常作業に有利であり、デスクトップソフトウェアは詳細な分析や最終図の準備により適している場合があります。例えば、サーモフィッシャーイメージングシステムは、船内取得・解析や外部ソフトウェアワークフローを提供しています。

元の画像ファイルはできるだけ長く保存してください。調整するには、表示される画像が生の取得データを置き換えるべきではありません。

予防措置を講じ、サンプルの安全性を確保するために追加の対策を講じてください

UVイメージング装置から発せられる直射または反射紫外線は、目や皮膚にダメージを与える可能性があるため、適切な遮蔽を行うことが重要です。露出は、開閉型UVライトボックスに比べてイメージングチャンバーを密閉することで軽減できます。

DNAをゲルから抽出する場合は、適切な核酸染色のためにブルーライト励起の方が適している場合があります。ホワイトライトイメージングは、見えるタンパク質の染色をUVで確認する必要を排除します。

また、サンプル間の汚染を防ぐよう設計されるべきです。サンプルトレイを洗い、バッファーのこぼれをできるだけ早く除去し、フィルター、レンズ、イメージング面の清掃に関してメーカーのガイドラインに従ってください。

システムが光学機器として設定されていることを確認してください

分子生物学イメージャーは時々掃除できるものではありません。

光源は時間とともに摩耗し、フィルターに傷がつき、サンプルトレイにシミがつき、ほこりが画像品質に影響を及ぼすことがあります。検査室は照明の追跡、トレイやフィルターの点検、取得プロトコルのバックアップ、ソフトウェアの慎重な更新、維持管理のドキュメントの維持などを行うべきです。

画質が良くない場合は、全工程を繰り返してカメラやチェーン全体に問題がないか確認してください。これは染色、試料、基質、露出設定、光源、フィルターなどが原因かもしれません。

結論

最も便利なプラットフォームが必ずしも機能が最も多いとは限りません。適切な照明、感度、ダイナミックレンジ、ソフトウェア、イメージング領域、ワークフローを提供し、他のユーザーが再現できるものです。

良好なイメージングは試料準備段階から始まります。装置は実験を記録しますが、アッセイの準備が慎重に行われ、取得が繰り返し行われる場合、画像(記録)は意味を持ちます。

よくある質問

Q1。分子生物学イメージングシステムは何を捉えられるのか?

設定に応じて、DNAおよびRNAゲル、タンパク質ゲル、化学発光ウェスタンブロット、蛍光ウェスタンブロット、比色膜を捕捉することができます。

Q2。ジェルドキュメンテーションシステムとウェスタンブロットイメージャーの違いは何ですか?

いつもではありません。基本的なゲルシステムはUV、青色光、白光によるイメージングのみをサポートし、ウェスタンブロットイメージャーは感度の高い化学発光や多チャネル蛍光検出を必要とする場合があります。

Q3。なぜダイナミックレンジが重要なのでしょうか?なぜダイナミックレンジが重要なのか?

信号のダイナミックレンジが広いことで、強い信号を飽和させることなく弱い信号と強い信号の両方を捕捉できます。これは特に定量的分析において顕著です。

Q4。自動曝露は信頼できるのでしょうか?

開始曝露範囲を決めるのが役立ちます。また、飽和度、背景、弱信号、イメージングモードなどの他の要因も観察する必要があります。

Q5。最適なイメージングモードは何ですか?

使用する方法は、試料、染色、ラベル、分析の目的によって異なります。光源、フィルター、カメラの設定はアッセイによって異なります。